[생물학 레포트] 균주 colony 관찰 및 균 수(세균 농도) 측정 실험

1. Title : 균 수의 측정

 

2. Date : 

 

3. Name : 

 

4. Purpose : 균의 colony forming 형태를 관찰하고 대략적인 cell의 농도를 확인한다.

 

 

5. Materials

균, 균 키울 plate(LB plate), spreader, 알코올램프, Pipette, tip, ep-tube

 

6. Methods

 

① Serial dilution을 통해 10-5까지 희석액을 만들어준다.

(final 100ul)

 

 

② 10-2에서 10-5까지(6조는 10-6까지) 한개씩 한 사람이

spreading해준다.

 

 

③ 그 다음날 colony 개수를 파악해 cell의 농도를 파악한다

 

<spread plate method>

 

① LB plate에 실험한 날짜, 조 이름, 접종 균주의 이름,희석 정도를 labeling한다.

② Pipette을 이용하여 미생물 배양액 100ul 따서 plate에 접종한다.

③ 멸균된 삼각봉을 이용하여 배양액을 뻑뻑함이 느껴질 때까지 골고루 펴서 도말 한다.

④ 도말이 끝난 배지는 뒤집어서 37℃ incubator에 24시간 배양한 후, 형성된 colony를 관찰한다.

 

<Colony counting>

 

① 배양이 끝난 plate를 희석 배수별로 정리한다.

② 확산 colony가 없고 한 plate에 30-300개의 colony가 있는 plate를 선택하여 colony 수를 센다.

 

③ 동일 희석배율의 평판배지에 형성된 colony 수의 평균을 구하고 희석배율을 곱하여

시료의 미생물 밀도를 구한다.

결과는 CFU/g 또는 CFU/㎖로 표시하고, 지수함수 형태로 표시하며,

유효숫자는 두 자리 또는 세 자리를 사용한다(A.BC x 10d CFU/g 또는 CFU/㎖).

 

 

 

<Quiz>

 

Q. Colony의 계수 및 계산 예시- 농도를 구하시오

어느 토양의 미생물 수를 평판배양법으로 측정한 결과는 다음 과 같다. 각 평판에는

0.1 ㎖의 시료를 주입하였다. 이 토양 시료의 미생물 밀도를 구하시오.

 

희석배수	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
집락수	TNTC TNTC TNTC	TNTC TNTC TNTC	184 156 176	45 33 15	3 (TFTC) 7 (TFTC) 1 (TFTC)

* TNTC-Too Numerous To Count

* TFTC-Too Few To Count

 

7. Results

균주 colony 형성 및 관찰

10의 -3승 plate

10의 -5승 plate

 

10의 –5승 plate에서는 94개의 colony를 관찰할 수 있었다.

이의 농도를 구하기 위해서

94 x 10의 –7승(기존 10의 –2승을 100퍼센트 농도로 보고 희석을 진행했기 때문에

실제로는 10의 –5승이 아닌 10의 –7승이다.) x 0.1

이므로 원래 미생물의 농도는 9.4 x 10의 9승이다.

 

8. Discussion

 

이번 실험은 직접 배양한 균주의 colony를 관찰하고 콜로니의 수를 counting함으로써 세균의 농도를 구하는 실험이었다. 우선 균주를 배양하기 위해서는 serial dilution과정이 필요하다. 실험에서는 10의 –2승인 미생물 배양액을 기반으로 희석을 진행하였다. 희석시킨 미생물 배양액을 LB배지에 도말하는 과정을 spread plate method라고 한다.

 

<spread plate method>

 

이번 실험에서는 조원 모두가 spread에 미숙하여 미생물이 잘 배양할 수 있는 환경을 유지하지 못하였다.

우리 조의 spread 과정에서 가장 큰 문제점은 바로 배지를 손상시킨 점이다.

serial dilution 과정을 거쳐서 10의 –3승, 10의 –4승, 10의 –5승 농도의 희석액을 만드는데 성공하였다.

이 희석액을 가지고 각각의 배지에 spread를 처음 시도하였을 때 힘 조절을 잘 하지 못하여 미생물이 성장해야할 배지가 크게 손상되었다. 이는 10의 –5승 실험 결과를 보면 관찰할 수 있다.

배지를 손상시킴으로써 미생물이 배양될 공간을 손실하였다.

 

두 번째로는 spread 과정을 완벽히 하지 못한 점이다. spread 과정은 배지가 뻑뻑해진 느낌이 들 때까지 하는 것이 정해진 프로토콜이지만, 우리가 생각하는 뻑뻑함의 기준이 균주가 배양하기 위한 조건을 충족하지 못해서

spread 과정을 완벽히 시행하지 못한 것 같다.

 

 

<colony counting>

 

배양 후 우리 실험 조는 plate의 colony를 counting하였다.

여기서 colony란 세균이나 곰팡이, 배양세포 등의 고형 배지 상의 눈에 보이는 덩어리를 뜻한다.

세균에서는 이식한 균의 밀도가 충분히 얇으면서 배양조건이 정해져 있으면

생성된 집락의 형태, 크기, 융기, 생지, 면의 조활, 연의 형상, 색조, 투명도, 덩어리의 질, 경연, 점조도, 특수배지의 착색 등은 종류에 따라 거의 일정한 특징을 나타내기 때문에 감별상 하나의 중요한 특징이 된다

 

 

이러한 특징을 가진 colony를 counting 결과, 우리 조의 plate에서는 총 94개의 세균을 counting할 수 있었다 (단, 300개 이상의 균 수가 예측되는 plate는 제외하였다.

이렇게 콜로니가 너무 많아서 카운팅이 불가한 것은 TNTC-Too Numerous To Count라고 하고, 콜로니 수가 너무 적은 것은 Too Few To Count라고 한다.)

본격적으로 세균의 농도를 구해보겠다.

 

->세균의 농도를 구하는 공식은 농도=콜로니의 평균 n수 x 희석배율 x 10이다.

이 공식에 우리의 실험 결과를 대입해보겠다. 우리의 콜로니 수는 94개였고, 희석배율은 10의 –7승이였다.(10의 –2승을 기준으로 시작하였음)

즉, 94 x 10의 7승 x 10= 9400000000이다.

9.4x10의 9승이 우리 조의 실험에 사용된 원액의 농도이자 균의 농도이다.

 

 

 

9. Project

 

① 오늘 실험한 방법 외에도 미생물의 세포량을 측정할 수 있는 방법을 조사하시오.

 

1. 생균수 측정법

 

식품 등의 시료 중에 존재하는 세균의 양을 측정하는 하나의 방법.

일정의 조건으로 콜로니를 만드는 세균수를 육안으로 측정한다.

세균수 측정법에는 총균수 측정법이라고 하여 생균도 사균도 동시에 염색하여 검경하는 법(우유에서 실시)도 있고 이것과 구별하여 생균수 측정법이라고 한다.

본 법에도 여러 가지 있어 페트리디시를 쓰는 평판법이 일반적이고 그 밖에 막 여과(membrane filter)나 시험관, 유리모세관을 쓰는 방법도 있다.

한천을 함유하는 배지 중 혹은 표면에 콜로니를 만들어 이것을 계측한다.

사용배지는 대상물에 따라 조성이 조금 다르고, 식품 위생법규로서는 표준한천배지를 사용하도록 규정되어 있다.

또한 특정한 균만을 측정하는 경우에는 선택배지를 사용한다.

배양온도, 시간은 대상과 목적에 따라 다르지만 35~37℃, 48시간 정도가 일반적이다.

생균수라고 하더라도 모든 생균이 콜로니를 만들고 있는 것은 아니고 일정의 배지조성, 배양시간, 배양온도에서 콜로니를 만드는 균만을 측정한다.

 

시료를 생리식염수 등으로 적시어 희석하여 그 1ml를 페트리접시에 넣어 배지를 부어 응고 후 부란기에 넣어 일정조건으로 배양 후 콜로니계산기(colony counter)에서 계측한다.

너무 콜로니가 많은 것은 제외하고 페트리디시에 30~300의 것을 계측하여 희석배율을 곱하여 시료중의 생균수로 한다.

 

 

 

2.콜로니카운트

 

세균검사에서 일종의 정량적 검사법이고 기인균의 추정에 사용된다.

주로 요중의 균수산정에 사용되는 경우가 많은데 객담이나 담즙으로도 실시되는 방법이다.

요에서는 우선 처음에 피검뇨의 도말검색을 하고 균수의 기준을 정해 요의 희석배수를 결정한다.

균수가 적을 때에는원래의 뇨를 사용하고 균수가 많은 경우에는 요를 102, 106에 희석해 한천과 혼합해서 평판으로 한 뒤, 일주일 동안 37°C로 배양한다.

그 뒤 콜로니(집락)수를 산정한다.

최근에는 이 분야에서도 자동화가 진전되어 자동적으로 산정시키는 것도 가능해졌다.

 

 

 

 

희석배수	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
집락수	TNTC TNTC TNTC	TNTC TNTC TNTC	318 304 297	96 108 88	6 (TFTC) 9 (TFTC) 4 (TFTC)

② 어느 토양의 미생물 수를 평판배양법으로 측정한 결과는 다음 과 같다. 각 평판에는 0.1 ㎖의 시료를 주입하였다. 농도를 구하시오.

* TNTC-Too Numerous To Count

* TFTC-Too Few To Count

 

농도: 97.3(집락수의 평균)x 10의 4승(희석 배율)x 10= 9.73x10의 6승

 

 

 

#

대학생 레포트

실험 레포트 양식

실험 레포트 쓰는법

생명과학 레포트

생물학 레포트

고등학생 과학 실험

과학 실험 추천

세균 관찰 실험 

세균농도측정 실험